凯氏定氮仪工作原理

测定蛋白质的方法可分为两大类：一类是利用蛋白质的物理化学性质来推算，如密度 、折射率
、紫外吸收、荧光性等；另一类是利用化学方法来计算 ，如定氮 、双缩脲反应
、染料结合反应、酚试剂反应等

主要测定方法有：双缩脲法 、染料结合法
、酚试剂法、紫外分光光度法 、水扬酸比色法、折光法
、旋光法、近红外光谱法.

目前蛋白质测定最常用的方法是凯氏定氮法
，是通过测总氮量来确定蛋白质含量的方法。

凯氏定氮法是通过测出样品中的总含氮量再乘以相应的蛋白质系数而求出蛋白质的含量,此法的结果称为粗蛋白质含量：由于样品中含有少量非蛋白质含氮化合物，如核酸 、生物碱
、含氮类脂、卟啉以及含氮色素等非蛋白质的含氮化合物.凯氏定氮法是测定总有机氮量较为准确 、操作较为简单的方法之一 ，可用于所有动
、植物食品的分析及各种加工食品的分析
，可同时测定多个样品，故国内外应用较为普遍 ，是个经典分析方法[6] 。至今仍被作为标准检验方法.此法可应用于各类食品中蛋白质含量测定

凯氏定氮法可分为全量法、微量法及经改进后的改良凯氏定氮法目前通常以硫酸铜作催化剂的常量 、半微量
、微量凯氏定氮法样品质量及试剂用量较少
，且有一套微量凯氏定氮器
。在凯氏法改良中主要的问题是，氮化合物中氮的完全氨化问题及缩短时间、简化操作的问题 ，即分解试样所用的催化剂。常量改良凯氏定氮法在催化剂中增加了二氧化钛[4].

在理化实验室,检验食品中蛋白质的含量通常用微量凯氏定氮法和全量凯氏定氮法.接下来以大量的试验来比较微量凯氏定氮法和全量凯氏定氮法的精确度的大小.

1.材料与方法：

1.1试验材料

1.1.1试验样品

面粉

1.1.2试验药品和试剂

所有试剂均为分析纯；水为蒸馏水或同等纯度的水 。

硫酸铜；

硫酸钾；

浓硫酸；

40％氢氧化钠溶液：称取40g氢氧化钠溶于60mL蒸馏水中；

4％硼酸溶液：称取4g硼酸溶于蒸馏水中稀释至lOOmL；

0．1mol／L盐酸标准滴定溶液；

甲基红次甲基蓝混合指示液：将次甲基蓝乙醇溶液(1g／L)与甲基红乙醇溶液(1g／L)按1+2体积比混合
。

1.1.3仪器和设备：

实验室常规仪器及下列各项：

凯氏烧瓶：500mL；

可调式电炉；蒸汽蒸馏装置；

铰肉机：

篦孔径不超过4nm；

组织捣碎机；

粉碎机；

研钵：玻璃或瓷质；

化学消化器，

凯氏定氮仪
，

空气滤过器

1.2试验方法

1.2.1微量凯氏定氮法

微量凯氏定氮法的原理

样品与浓硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解 ，其中碳和氢被氧化为二氧化碳和水逸出
，而样品中的有机氮转化为氨与硫酸结合成硫酸铵。然后取消化液的1/10加碱蒸馏，使氨蒸出 ，用硼酸吸收后再以标准盐酸或硫酸溶液滴定[2] 。根据标准酸消耗量可计算出蛋白质的含量
。包括消化 、蒸馏
、吸收、滴定四个步骤

1.2.2全量凯氏定氮法

全量凯氏定氮法的原理

样品与浓硫酸和催化剂一同加热消化
，使蛋白质分解，其中碳和氢被氧化为二氧化碳和水逸出 ，而样品中的有机氮转化为氨与硫酸结合成硫酸铵。然后取消化液的全部加碱蒸馏
，使氨蒸出，用硼酸吸收后再以标准盐酸或硫酸溶液滴定 。根据标准酸消耗量可计算出蛋白质的含量。包括消化 、蒸馏、吸收
、滴定四个步骤

2 分析过程

试样制备：固体样品：取有代表性的样品至少200g ，用研钵捣碎、研细；不易捣碎 、研细的样品应切(剪)成细粒；干固体样品用粉碎机粉碎；液体样品：取充分混匀的液体样品至少200g
。粉状样品：取有代表性的样品至少200g(如粉粒较大也应用研钵研细)
，混合均匀；糊状样品：取有代表性的样品至少200g，混合均匀；固液体样品：按固
、液体比例 ，取有代表性的样品至少200g，用组织捣碎机捣碎
，混合均匀；肉制品：取去除不可食部分、具有代表性的样品至少200g，用铰肉机至少铰两次 ，混合均匀。上述试样应放入密闭玻璃容器中
，于4°C冰箱内贮存备用，尽快测定 。

2.1微量凯氏定氮法的分析过程

2.1.1样品消化 :

步骤：准确称取一定量的样品 ，加入硫酸铜0.5g 、硫酸钾10g和浓硫酸20mL
、玻璃珠数粒→小心移入干燥洁净的500ml凯氏烧瓶中(固体或粉末用纸卷成纸筒送入)
，轻轻摇匀，以45?斜支于有小孔的石棉网上→用电炉以小火加热(或先烧瓶放在距电炉较远处) ，待内容物全部炭化、泡沫停止产生后→加大火力(或将烧瓶放在电炉上)
，保持瓶内液体微沸→至液体变蓝绿色透明后→继续加热微沸30min→关闭电炉，取下烧瓶 、冷却→转移至100ml容量瓶中 ，加水定容

2.1.2 蒸馏与吸收：

按图安装好微量定氮蒸馏装置
。于水蒸气发生瓶内装水至2/3容积处
，加甲基橙指示剂数滴及硫酸数毫升，以保持水呈酸性 ，加入数粒玻璃珠。在接受瓶中加入10ml40g/L硼酸及2滴混合指示剂，将冷凝管下端插入液面以下 。准确吸取消化液10mL于反应管内
，经漏斗再加入10mL氢氧化钠溶液，用少量蒸馏水冲洗漏斗 ，夹好漏斗夹并水封
，加热煮沸水蒸气发生瓶内的水进行蒸馏
。指示剂变绿色后继续蒸馏10min，将冷凝管尖端提离液面继续蒸1min

凯氏定氮法的实验原理是什么

凯氏定氮仪是根据蛋白质中氮的含量恒定的原理 ，通过测定样品中氮的含量从而计算蛋白质含量的仪器。因其蛋白质含量测量计算的方法叫做凯氏定氮法
，故被称为凯氏定氮仪，又名定氮仪
、蛋白质测定仪、粗蛋白测定仪 。

一 、实验原理

　蛋白质是含氮的有机化合物
。蛋白质与硫酸和催化剂一同加热消化 ，使蛋白质分解
，分解的氨与硫酸结合生成硫酸铵。然后碱化蒸馏使氨游离，用硼酸吸收后再以硫酸或盐酸标准溶液 滴定 ，根据酸的消耗量乘以换算系数
，蛋白质含量 。含氮量*6.25=蛋白含量

1.有机物中的胺根在强热和CuSO4，浓H2SO4 作用下 ，硝化生成（NH4）2SO4

凯氏定氮法

凯氏定氮法反应式为：

2NH2+H2SO4+2H=(NH4)2SO4 （其中CuSO4做催化剂）

2.在凯氏定氮器中与碱作用，通过蒸馏释放出NH3
，收集于H3BO3 溶液中反应式为:

(NH4)2SO4+2NaOH=2NH3+2H2O+Na2SO4

2NH3+4H3BO3=(NH4)2B4O7+5H2O

3. 用已知浓度的H2SO4（或HCI）标准溶液滴定，根据HCI消耗的量计算出氮的含量 ，然后乘以相应的换算因子
，既得蛋白质的含量

反应式为：

(NH4)2B4O7+H2SO4+5H2O=(NH4)2SO4+4H3BO3

(NH4)2B4O7+2HCl+5H2O=2NH4Cl+4H3BO3

　二
、操作

　1、 样品处理：精密称取0.2-2.0g固体样品或2-5g半固体样品或吸取10-20ml液体样品（约相当氮30-40mg），移入干燥的100ml或500ml定氮瓶中 ，加入0.2g硫酸铜
，6g硫酸钾及20毫升硫酸，稍摇匀后于瓶口放一小漏斗 ，将瓶以45度角斜支于有小孔的石棉网上
，小火加热，待内容物全部炭化 ，泡沫完全停止后
，加强火力，并保持瓶内液体微沸 ，至液体呈蓝绿色澄清透明后，再继续加热0.5小时
。取下放冷
，小心加20ml水，放冷后 ，移入100ml容量瓶中
，并用少量水洗定氮瓶，洗液并入容量瓶中 ，再加水至刻度
，混匀备用。取与处理样品相同量的硫酸铜 、硫酸钾、浓硫酸同一方法做试剂空白试验 。但是此法比较危险，不易在实验室演示 ，现在大多数实验室有消煮仪一次可以进行多个（一次可以消煮16个样品）样品处理
，并有通风橱进行通风，温度可以自己设定 ，更加安全和可操作性
，因此逐步成为主要的凯氏定氮法的首选处理方法。

一般消解温度都设在240度及240度以上，如果想快速消解可以适当提高温度甚至可以用最大温度进行消解
。

2
、按图装好定氮装置 ，于水蒸气发生器内装水约2/3处加甲基红 指示剂数滴及数毫升硫酸，以保持水呈酸性
，加入数粒玻璃珠以防暴沸，用调压器控制 ，加热煮沸水蒸气发生瓶内的水。

3、向接收瓶内加入10ml 2%硼酸溶液及混合指示剂1滴
，并使冷凝管的下端插入液面下，吸取10.0ml样品消化液由小玻璃杯流入反应室 ，并以10ml水洗涤小烧杯使流入反应室内
，塞紧小玻璃杯的棒状玻璃塞 。将10ml 40%氢氧化钠溶液倒入小玻璃杯，提起玻璃塞使其缓慢流入反应室 ，不能立即将玻璃盖塞紧
，这样易使玻璃塞粘在进样口，应先用蒸馏水冲洗然后再盖 ，并加水于小玻璃杯以防漏气
。夹紧螺旋夹
，开始蒸馏，蒸气通入反应室使氨通过冷凝管而进入接收瓶内 ，蒸馏5min。移动接收瓶，使冷凝管下端离开液皿
，再蒸馏1min，然后用少量水冲洗冷凝管下端外部 。取下接收瓶 ，以0.05N硫酸或0.05N盐酸标准溶液定至灰色或蓝紫色为终点
。

同时吸取10.0ml试剂空白消化液按3操作。

三 、计算

X =(（V1-V2）*N*0.014)/( m*（10/100）) *F*100%

X：样品中蛋白质的百分含量
，g；

V1：样品消耗硫酸或盐酸标准液的体积，ml；

V2：试剂空白消耗硫酸或盐酸标准溶液的体积 ，ml；

N：硫酸或盐酸标准溶液的当量浓度；

0.014：1N硫酸或盐酸标准溶液1ml相当于氮克数；

m：样品的质量（体积）
，g（ml）；

F：氮换算为蛋白质的系数  。蛋白质中的氮含量一般为15～17.6%，按16%计算乘以6.25即为蛋白质 ，乳制品为6.38
，面粉为5.70，玉米
、高粱为6.24 ，花生为5.46
，米为5.95，大豆及其制品为5.71 ，肉与肉制品为6.25，大麦、小米 、燕麦
、裸麦为5.83
，芝麻、向日葵为 5.30
。